MM_FS_CNJ_0125 出口肉及肉制品中粘菌素残留量检验方法

MM_FS_CNJ_0125出口肉 肉制品 鸭肉 粘菌素 残留量 杯碟法

MM_FS_CNJ_0125

      出口肉及肉制品中粘菌素残留量检验方法

1.适用范围

    本方法适用于出口鸭肉中粘菌素残留量的检验。

2.原理概要

    用磷酸盐缓冲液抽提试样中残留的粘菌素，经均质、离心，取上清液进行杯碟法测定。利用样液中的残留粘菌素与支气管败血性博代氏杆菌的作用，根据产生抑菌圈的大小用标准曲线法定量。

3.主要试剂和仪器

3.1.主要试剂

    粘菌素甲基磺酸钠标准品：已知效价标准品,1μg相当于0.613μg粘菌素；

    缓冲液Ⅰ：pH6.0±0.1,称取80.0g无水磷酸二氢钾溶于700mL水中，另取20.0g无水磷酸氢二钾溶于300mL水中，两者混合，于121℃高压灭菌15min；

    缓冲液Ⅱ：pH6.0±0.1，称取80.0g无水磷酸二氢钾溶于700mL水中，另取20.0g无水磷酸氢二钾溶于300mL水中，两者混合。称取铁以0.2%比例溶解于该溶液中；

    试验菌种：支气管败血性博代氏杆菌(Bordetella bronchise ptica)，由美国标准菌株收藏中心提供，菌株号ATCC 4617；

    粘菌素标准储备液：称取适量的粘菌素甲基磺酸钠标准品(精确到0.1mg)，用缓冲液Ⅰ溶解并制备成浓度为1000μg/mL的粘菌素标准储备液。置4℃保存，可使用8天；

    粘菌素标准工作液：分别吸取一定量粘菌素标准储备液，用缓冲液Ⅰ稀释成浓度为0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2μg/mL的粘菌素标准工作液。需当日配制和使用；

    培养基Ⅰ(见附录A中A1)；

    培养基Ⅱ(见附录A中A2)；

    培养基Ⅲ(见附录A中A3)；

3.2.仪器

    培养皿：内径90mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖；

    牛津杯：不锈钢圆筒，外径(8.0±0.1)mm，内径(6.0±0.1)mm，高度(10.0±0.1)mm；

    游标卡尺：测量范围0～200mm，精度0.02mm，或抑菌圈测量仪；

    绞碎机：电动；

    均质器：不低于10000r/min；

    离心机：不低于4000r/min；

    恒温培养箱：(36±1)℃，搁板应保持水平；

    高压灭菌器；

    恒温水浴锅：恒温±1℃；

4.试样的抽取与制备

4.1.检验批

    以不超过2500件为一检验批。

    同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。

4.2.抽样数量

4.3.抽样方法

    按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取500g(或一袋)作为原始样品，抽取的原始样品总量不少于2kg，放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。

4.4.试样制备

    从所取回的原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入绞碎机中绞碎，充分混匀。用四分法缩分至不少于500g作为试样。装入清洁容器内，加封后标明标记。

4.5.试样保存

    将试样于－18℃以下冷冻保存。

注：在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

5.过程简述

5.1.样液制备

    称取10.0g试样(精确至0.1g)于均质杯内，加入10mL缓冲液Ⅱ，搅匀，放置60min，均质2min(10000r/min)后，放入水浴锅中煮沸3min。移入离心管中离心不少于10min(4000r/min以上)，取出上清液。在残渣中再加10mL缓冲液Ⅱ，按上述方法均质、离心，取出上清液。合并两次上清液，并定量为20mL作为样液。

5.2.菌悬液的制备

    将支气管败血性博代氏杆菌接种于培养基Ⅰ制成的试管斜面上于(36±1)℃培养16～24h后，再转种到培养基Ⅱ中，于(36±1)℃培养16～24h，制成菌悬液(使用时注意摇匀)。

5.3.菌悬液最佳用量测定

    测试前应先用0.025μg/mL粘菌素标准工作液，对上述菌悬素液进行预测试。以不同量的菌悬液加入经熔化并冷却至45～50℃的培养基Ⅲ中，充分混合，并经(36±1)℃培养(17±1)h后，选择能使用标准工作液产生直径大于等于10mm清晰完整的抑菌圈的菌悬液加入量，即为菌悬液的最佳用量。

5.4.检定平板制备

    将培养基Ⅲ熔化，注20mL于灭菌培养皿内保持水平，待其凝固，作为基层。另取培养基Ⅲ熔化，冷却至45～50℃，加入上述测得的最佳菌悬液用量，充分混合，取约4mL注入已铺有基层培养基的平板中作种层，保持水平，使其凝固，制成检定用的平板。所用平板需当天制备。

5.5.标准曲线的绘制

    用粘菌素标准工作液绘制标准曲线。以0.05μg/mL浓度的标准工作液为参考浓度；以0.0125μg/mL浓度的标准工作液作阴性对照用。每个标准工作液浓度取三个检定平板作为一组，每个平板上置4个牛津杯，使牛津杯在半径为2.5cm的圆面成90°角间距，对角两个杯中注满0.05μg/mL参考浓度标准工作液，另两个对角杯中注满其他浓度的一种标准工作液。4个浓度标准工作液共12个检定平板，用于制备标准曲线。其中0.05μg/mL参考浓度的标准工作液将得到24个抑菌圈直径的数值，而其他标准工作液分别得到6个抑菌圈直径的数值。

    盖好平皿盖，置(36±1)℃培养(17±1)h。翻转平板，除去牛津杯，测量各个浓度产生的抑菌圈直径(精确到0.1mm)，求得各自的平均值。再求出0.05μg/mL参考浓度24个抑菌圈直径的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值的差，即为各组平板的校正值。将校正后的值用式(1)和式(2)算出L和H点的直径值，在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径为横坐标(算术级)，粘菌素浓度为纵坐标(对数级)，通过L和H点连一直线即为标准曲线。

式中：L——标准曲线上最低浓度抑菌圈的直径，mm；

H——标准曲线上最高浓度抑菌圈的直径，mm；

b——参考浓度0.05 μg/mL的24个抑菌圈直径的平均值，mm；

a、c、d——分别表示标准曲线上其他标准工作液浓度(0.025、0.1、0.2μg/mL)的抑菌圈直径经校正后的平均值，mm。

5.6.样液的测定

    每份样液取3个检定平板，在每个平板上置4个已灭菌的牛津杯(按制备标准曲线方法放置)，在对角的2只牛津杯里注满被检样液，在剩余的2只牛津杯里分别注满粘菌素参考浓度标准工作液(即0.05μg/mL)。于(36±1)℃培养(17±1)h，翻转平板，除去牛津杯。如有抑菌圈产生，量取抑菌圈直径(精确到0.1mm)。

6.结果的计算

    如样液抑菌圈的直径小于10mm，即报告为“阴性”。

    如样液抑菌圈的直径大于等于10mm，求出每组三个检定平板上样液和参考浓度标准工作液抑菌圈直径的平均值，经校正后，从标准曲线上查出相应的粘菌素的浓度，通过式(3)，计算试样中粘菌素残留的含量：

式中：X——试样中粘菌素残留的含量，mg/kg；

c——从标准曲线上查得样液中粘菌素浓度，μg/mL；

m——每毫升最终样液所代表的试样量，g。

注：如测定结果呈阳性，即所显的抑菌圈直径的平均值大于等于10mm，必要时尚需进行确证试验(可用薄层层析法，参见附录B)，以证明抑菌物确系粘菌素。

7.低限和回收率的测定

7.1.测定低限

    本方法的测定低限为0.05mg/kg。

7.2.回收率

    鸭肉中粘菌素添加浓度及其回收率的实验数据：

0.050mg/kg时，回收率为78.0%；

0.100mg/kg时，回收率为85.0%；

0.200mg/kg时，回收率为90.0%。

8.来源：

    SN  0668—1997